蛋白免疫印迹（Western Blot）采用的是变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离蛋白质混合物 ，经过SDS-PAGE分离的蛋白质被到转移到固相支撑物(NC膜 ，PVDF膜等)上后 ，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质 ，且能保持膜上蛋白质或多肽的抗原性质不变 ，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原 ，与其对应的抗体发生免疫反应 ，一抗再与酶标记的二抗起反应 ，经过底物显色以检测特异蛋白质表达水平 。

由于Western blot技术服务具有简便 ，快捷等特点 ，所以目前该技术也被广泛应用于蛋白质表达水平的检测 。

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 Western blot实验步骤 

1 、Western blot蛋白质提取 ：根据实验目的的不同选择不同的裂解液 ，如RIPA裂解液 、NP-40裂解液 、SDS裂解液 ，同时根据蛋白质提取组分的不同选择不同的方法 ，如提取核蛋白 ，细胞质蛋白 ，膜蛋白等 。

2 、蛋白定量 ：根据蛋白质的提取条件不同 ，可采取不同的定量方法 ，如bradford法 、BCA法等 。

3 、电泳 ：依据需要检测蛋白的分子量选取分离胶的浓度 ，分别配置分离胶和积成胶 ，凝胶凝固后进行蛋白质上样和电泳 。

4 、转膜 ：可采取半干法和湿法转移 ，当采取半干法转膜时需防止短路 ：从下到上的顺序 ：滤纸/PVDF膜/凝胶/滤纸/阴极(bio-rad转膜仪) 。

5 、封闭 ：5%脱脂奶粉或5% BSA封闭过夜或室温1小时,孵育时间可根据实验需要进行改变 。

6 、一抗孵育 ：5%脱脂奶粉稀释一抗到合适的浓度 ，与膜室温孵育1小时或4度过夜 ，孵育时间可参考抗体说明书 ，并加以优化 ，一抗孵育后TBST洗膜3次 ，每次5分钟 。

7 、二抗孵育 ：5%脱脂奶粉稀释二抗到合适的浓度 ，与膜室温孵育1小时 ，TBST洗膜3次 ，每次5分钟 。

8 、显影(ECL法) ：将A 、B两种底物按比例稀释混合均匀后滴在膜上 ，置于压片盒中 ，迅速盖上胶片 ，关闭胶盒进行曝光 ，曝光一定时间后取出胶片 ，浸入显影液中显影 ，直到出现清晰的蛋白质条带 ，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影 ，清水冲净晾干 ，标定Marker ，扫描胶片和Western blot 图片分析 。

 Western blot实验送检要求 

新鲜或正确保存的组织 、细胞或蛋白样品 。

组织样品 ：每份样品约２５０～５００ｍｇ ，１０－１５ｍｇ／ｍｌ；

细胞样品 ：每份样品约１×１０６～１×１０７　细胞数 ，浓度＞１μｇ／μｌ；

蛋白样品 ：裂解样品总蛋白量＞５００μｇ／样品 ，浓度≥２μｇ／μｌ 。

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